Tato práce se umístila na prvním místě v kategorii „nejlepší přehledový článek“ soutěže „“-2014.
Jak víte, jednou světlo byl úspěšně oddělen od tma. Stále musíme přijít na to, co je tma. V tomto směru byly zatím jen nějaké vyhlídky v souvislosti se studiem o temná hmota A temná energie. Ale lidstvo již dlouhou dobu úspěšně studuje a využívá světlo, mimo jiné jako výzkumný „nástroj“. S fenoménem souvisí jedna z oblastí využití světla v experimentálním výzkumu fluorescence. Za posledních třicet let se používání různých technik založených na fluorescenci v biologickém a lékařském výzkumu rychle zvýšilo. Je to způsobeno jednak vznikem nových technických možností – především počítačů a laserů –, tak širokou škálou dostupných fluorescenčních molekul a molekulárních komplexů. Jako by mikroskopičtí reportéři tyto sloučeniny nám speciálními světelnými signály říkají o vlastnostech molekulárního světa, ve kterém se nacházejí. Fluorescenční metodologie poskytla řešení mnoha základních problémů v biologii a medicíně. Díky své vysoké citlivosti a komparativní bezpečnosti nahradil mnoho tradičních metod spojených s používáním radioaktivních látek. Metody fluorescenční analýzy se používají jak v základním výzkumu k získávání nových poznatků o živých věcech, tak v aplikované práci v biotechnologii, lékařské diagnostice, kriminalistice a mnoha dalších oborech. Co jsou fluorescenční reportéři? Jaké informace lze s jejich pomocí získat z hlubin mikrosvěta? Jak se tyto informace zaznamenávají a analyzují? Ale za prvé - co je fluorescence?
Některé látky po absorpci světla v určitém rozsahu vlnových délek začnou vyzařovat světlo v jiném, delším rozsahu vlnových délek. Tento jev byl poprvé popsán jako viditelná změna barvy roztoků určitých organických sloučenin a minerálů při pozorování nikoli v procházejícím světle (v procházejícím světle), ale pod úhlem k procházejícímu světlu. Sir David Brewster si například v roce 1833 všiml, že když je zelený alkoholový roztok chlorofylu osvětlen bílým světlem, červené světlo se od něj „odráží“. Později, v roce 1845, Sir John Herschel popsal podobná pozorování – objevení se modré barvy v bezbarvém roztoku chininsulfátu při ozáření slunečním světlem. V roce 1852 objevil George Gabriel Stokes viditelné záře minerálu do oka fluorit když je ozářena neviditelný ultrafialové záření. Vzhledem ke zdroji původu pozorované záře tento jev nazval fluor escence, jak poznamenal, analogicky s termínem opál escence popisující jev dichroismus v hanbě. Je důležité poznamenat, že tyto termíny nejen odrážejí "historii" svého původu, ale co je důležitější, odkazují na různé fyzikální jevy. Fluorescence- Tohle záření, vznikající v molekulách látky pod vlivem světla. Opalescence - Tento rozptylování světlo, které je někdy doprovázeno rušením.
Fluorescence je ve své podstatě jednou z odrůd luminiscence. Tento termín popisuje všechny jevy záření látky způsobené „excitací“ molekul různými faktory. Například při některých chemických reakcích dochází hemi luminiscence. Chemiluminiscence v biologických objektech se nazývá bio luminiscence*. Existují látky, které při buzení elektrickým proudem vyzařují světlo ( elektro luminiscence), rychlé elektrony ( katoda luminiscence), γ-záření ( rádio luminiscence) a další. V této souvislosti do této kategorie spadá fluorescence fotografie luminiscence.
* - Nedávno byl publikován úžasný článek o „biomolekulách“ popisující objev nového typu bioluminiscence: « » . - Ed.
Nazývají se atomy, molekuly a molekulární komplexy schopné fluorescence fluorofory nebo fluorochromy. Obvykle se tyto termíny používají jako synonyma. V řadě zdrojů jsou však fluorochromy chápány jako všechny typy fluorescenčních molekul a fluorofory jsou chápány pouze jako fluorescenční složka (skupina) velké molekuly. Klasická monografie J. R. Lakowitze používá pro všechny typy fluorescenčních látek pouze jeden termín, fluorofor. Z důvodu konzistence budeme tento termín používat. Poznamenáváme také, že ve výzkumné praxi se obvykle nazývá fluorescenční složka kovalentně navázaná na makromolekule fluorescenční značka a volný fluorofor je sonda. Fluorofory používané v mikroskopii se tradičně nazývají fluorescenční barviva. Konečně začali někteří autoři tento termín používat biosenzory ve vztahu k fluoroforům používaným v biologickém výzkumu.
Fyzikální podstatu fluorescence je vhodné ilustrovat pomocí diagramu, který navrhl polský fyzik Alexander Jablonsky v roce 1933 a který nese jeho jméno. Obrázek 1 ukazuje zjednodušenou formu tohoto diagramu.
Obrázek 1. Jablonského diagram, ilustrující elektronické procesy v molekulách fluoroforů během absorpce světelných kvant. Vodorovné čáry- energetické hladiny elektronů: S 0- základní, nevybuzený stav; S 1- singletový excitovaný stav; 0–3 - kvantované podúrovně; T 1, T 2- kvantované hladiny excitovaného stavu tripletu. Šipky ukazují přechody elektronů do různých energetických stavů: P- pohlcování světla, Fl, Fosf- emise fluorescence, respektive fosforescence, VK- vnitřní konverze, IR- interkombinační konverze, VR- vibrační relaxace.
Když jsou fotony určité energie absorbovány v molekule fluoroforu, elektrony přecházejí z „země“ (S 0) do jedné z podúrovní „excitovaného“ (S 1, S 2, ..., S n) stavu s vyšší energii. Spin elektronu se při přechodu nemění, a proto se těmto hladinám říká singlet. „Excitovaný“ stav je nestabilní a elektrony se rychle vrátí na svou původní energetickou hladinu. To se může stát několika způsoby. Tři z nich jsou nezářivé kvantové přechody: vnitřní konverze, interkombinační konverze A vibrační relaxace. Další dva jsou doprovázeny vyzařováním světla – tímto fluorescence A fosforescence. Při vnitřní přeměně energie elektronu klesá na minimální úroveň singletu. Během vibrační relaxace, která je způsobena především interakcí s okolními molekulami, může být absorbovaná energie „rozptýlena“ jako teplo na „základní“ úroveň. Mezisystémové křížení vede k poklesu energie elektronů se změnou spinu. Tento energetický stav elektronu se nazývá triplet. K fluorescenci dochází při přechodu z úrovně spodního singletu do „základního“ stavu a k fosforescenci dochází při přechodu do „základního“ stavu z úrovně tripletu.
Všimněme si tří důležitých okolností.
Fluorescence je charakterizována řadou parametrů, které se mění v závislosti na fyzikálním prostředí nebo chemické modifikaci fluoroforu. Tyto parametry jsou „jazykem“, ve kterém jsou přenášeny informace z fluorescenčního reportéru. Pokračujeme-li v přirovnání, pak samotné parametry, stejně jako slova, nabývají konkrétního významu pouze s určitou jejich kombinací a v kontextu. „Kontextem“ fluorescenčních parametrů jsou podmínky, za kterých jsou zaznamenávány. Fluorescence všech fluoroforů má pět klíčových charakteristik: absorpční a fluorescenční spektrum, stejně jako kvantový výtěžek, životnost a fluorescenční anizotropii.
Každý fluorofor má individuální absorpční a fluorescenční spektra . Pro ilustraci obrázek 2 ukazuje spektra Lyso Tracker TM Blue (Molecular Probes®) a fluoresceinu. Hlavními parametry spekter jsou intenzita fluorescence, poloha maxim a tzv. poloviční šířka (šířka spektra na úrovni poloviny maxima). Často jsou to právě tyto parametry, které „informují“ o určitých vlastnostech prostředí, ve kterém se reportér nachází. Tak dochází k charakteristickým změnám ve fluorescenčním spektru mnoha fluorochromů při různých hodnotách pH. Obrázek 2 ukazuje závislost fluorescenčního spektra Lyso Sensor TM Yellow/Blue (Molecular Probes®) jako příklad na pH. Pokud jsou takové změny specifické, tzn. může být způsobena pouze posuny pH, pak může být tento fluorofor reportérem pH. Jedním z takových reportérů je Lyso Sensor TM Yellow/Blue.
Fluorescenční kvantový výtěžek je charakteristika účinnosti, s jakou se absorbovaná energie přeměňuje na záření ve srovnání s neradiačními relaxačními procesy. Kvantitativně je kvantový výtěžek definován jako poměr počtu emitovaných fotonů k počtu absorbovaných. Čím vyšší je kvantový výtěžek, tím větší je intenzita fluoroforu. Tento indikátor je často rozhodující při výběru fluoroforu pro roli fluorescenčního reportéra. Například fluorescein má kvantový výtěžek asi 0,9, což zajišťuje jeho široké použití jako nezávislé sondy i jako fluorescenční značky nefluorescenčních molekul. Je také důležité, že tento indikátor je velmi citlivý na různé fyzikálně-chemické interakce reportéra.
Životnost fluorescence je průměrná doba, během níž jsou molekuly fluoroforu v excitovaném stavu před emitováním fluorescenčních fotonů. Tento indikátor je měřen poklesem fluorescence po krátkodobé excitaci. Životnost fluorescence je na jedné straně velmi „citlivá“ na fyzikálně-chemické „prostředí“, ve kterém se fluorescenční reportér nachází. Na druhou stranu je tento indikátor specifickou charakteristikou fluoroforu, která z něj umožňuje získávat „reporty“ v přítomnosti jiných fluorescenčních molekul s podobnými spektrálními charakteristikami.
Fluorescenční anizotropie je kvantitativní charakteristika závislosti fluorescenční polarizace na polarizaci vzrušujícího světla. Na základě anizotropie lze posoudit rotační pohyblivost reportéru a tím i viskozitu média v jeho mikroprostředí.
Pět výše uvedených parametrů fluorescence jsou přímo měřitelné charakteristiky záření, které reportéři „vysílají“. Informační schopnosti fluorescenčních reportérů se však neomezují pouze na toto. S fluorescencí je spojena řada jevů, které se používají jako metodologické „triky“ k získání té či oné informace od fluorescenčních reportérů.
Například existuje fenomén nezářivého (rezonančního) přenosu energie (NTE) z jednoho fluoroforu na druhý. V tomto případě intenzita fluorescence donoru energie klesá a akceptoru se zvyšuje. To se může stát mezi fluorofory s určitými spektrálními vlastnostmi, a co je obzvláště důležité, pokud jsou v poměrně blízké vzdálenosti. WPT je základem mnoha metodických přístupů, které umožňují detekovat interakci molekul. Určení účinnosti neradiačního přenosu energie dokonce umožňuje odhadnout vzdálenost mezi molekulami. V tomto ohledu se WPT někdy nazývá „molekulární vládce“ (viz: « » ).
Řada metodologických možností je založena na zhášení fluorescence. Zhášení může být způsobeno fyzikální interakcí fluoroforu se zhášecími molekulami - jako je kyslík, halogeny, aminy a také některé organické molekuly s nedostatkem elektronů. V tomto případě může fluorescenční reportér „hlásit“ přítomnost určitých „zhášečů“ ve svém prostředí.
K zhášení fluoroforů může dojít také v důsledku fotobělení pod vlivem záření o vysoké intenzitě. Ve většině případů se z hlediska registrace fluorescence jedná o negativní jev. Ve „schopných rukou“ je však tento fenomén využíván jako speciální metodická technika. Technika obnovení fluorescence fluoroforu po fotobělení se rozšířila při studiu viskozity a/nebo difúzních vlastností buněčné cytoplazmy. Jeho podstata spočívá v tom, že na malé ploše buňky obsahující fluorofor je vybělen krátkodobým výkonným laserovým zábleskem. Poté je zaznamenáno obnovení fluorescence ve stejné oblasti, které je způsobeno nebělenými molekulami fluoroforu difundujícími z jiných oblastí buňky. Dynamika tohoto procesu charakterizuje difúzní vlastnosti cytoplazmy.
Mnoho látek s určitými elektronovými konfiguracemi má schopnost fluorescence. Takové konfigurace se vyskytují v některých atomech, molekulách a supramolekulárních komplexech. K identifikaci potenciální „schopnosti“ fluoroforu působit jako molekulární reportér pro biologický a lékařský výzkum jsou však vyžadovány speciální studie. Tyto „schopnosti“ se posuzují podle specifičnosti informací, které zprostředkovávají, jejich stabilita, v některých případech se bere v úvahu především fotostabilita, toxicita pro jednotlivé buňky nebo organismus. Charakteristickým rysem fluorescenčních „korespondentů“ je jejich vysoká individuální „specializace“. „Specializace“ každého reportéra je charakterizována jeho interakcí s určitými složkami biologického systému a také specificitou fluorescenčních signálů. Konvenčně můžeme rozlišit dvě skupiny reportérů vytvořených na zákl organické A anorganické fluorofory.
Organické fluoroforové molekuly představují největší a nejrozmanitější skupinu fluorescenčních reportérů. Jak velká je tato rozmanitost, lze ocenit při pohledu na katalog Molecular Probes, společnosti specializující se na vývoj a výrobu fluoroforů od roku 1975. Jedná se již o jedenácté vydání (aktualizaci) katalogu (v době psaní článku), což naznačuje vysoké tempo vývoje v této oblasti.
Široká škála organických fluorescenčních reportérů je způsobena širokou škálou úkolů a podmínek jejich aplikace. Při výběru nebo vývoji reportérů se berou v úvahu informace, které mají být získány, spektrální vlastnosti fluoroforu a také speciální podmínky spojené s charakteristikami studovaného systému. Ukažme si to na příkladu fluoresceinu a jeho derivátů (obr. 4). Jak již bylo uvedeno, tento fluorofor má vysoký kvantový výtěžek a tedy jasnou fluorescenci. Může fungovat jako reportér pH. Není však například vhodný pro měření pH uvnitř buněk, protože neproniká cytoplazmatickou membránou. Jeho „dodání“ do buněk lze provést pomocí hydrofobního derivátu - fluorescein diacetátu, který ztratil schopnost fluorescence, ale může proniknout hydrofobní bariérou cytoplazmatické membrány. V buňkách esterázy odštěpují acetylové skupiny a fluorescein končí v buňkách. Dichlorfluorescein se do buněk dodává podobným způsobem, tzn. přes esterifikovaný derivát. Tento reportér slouží k záznamu přítomnosti reaktivních forem kyslíku v buňkách. Zavedení isothiokyanátu do molekuly fluoresceinu umožňuje připojit fluorochrom na aminoskupiny nefluorescenčních molekul. Pomocí fluorescein isothiokyanátu se vytvářejí vysoce specifické fluorescenční proteinové reportéry - různé protilátky, streptavidin (biotinové činidlo), ale i nukleotidy a oligonukleotidy. A konečně, fluorescein 5-karboxymethoxy-2-nitrobenzylester (není znázorněn na obrázku 4) je nefluorescenční derivát, který může být konvertován na běžný fluorescein, když je ozářen světlem při 355 nm. Toto je příklad fotoaktivovatelných fluoroforů, jejichž fluorescenční vlastnosti jsou před ozářením „uzavřeny“.
Obrázek 4. Strukturní vzorce fluoresceinu a některých jeho derivátů.
V sedmdesátých letech dvacátého století zaměstnanec Princetonské univerzity (USA) Osamu Shimomura ( Osamu Shimomura) při studiu bioluminiscence medúzy Aequorea victoria izolovali dva proteiny zapojené do tohoto procesu. Zjistil, že při interakci vápenatých iontů s jedním z izolovaných proteinů dochází k modré chemiluminiscenci. V tomto případě může druhý protein absorbovat modré světlo a fluoreskovat zeleně, což dává medúzám nazelenalý odstín. První protein byl pojmenován aequorin, druhý zelený fluorescenční protein (GFP). Od tohoto okamžiku začíná příběh jednoho z nejúspěšnějších vývojů v molekulární biologii a jeho hlavními postavami jsou Osamu Shimomura, Martin Chalfie ( Martin Chalfie) a Roger Tsien ( Roger Tsien) získali v roce 2008 Nobelovu cenu za chemii za objev a podrobné studium ZFB. Co je na tomto proteinu tak pozoruhodného?
Po objevení ZFB začal intenzivní výzkum jeho struktury a byl syntetizován a klonován odpovídající gen. Kromě toho někteří mořští bezobratlí ( Hydrozoa A Anthozoa) byly objeveny podobné fluorescenční proteiny, jejichž struktura byla také charakterizována. To vše umožnilo pomocí metod molekulární biologie cíleně konstruovat geny kódující modifikované formy ZPB s širokou škálou spektrálních charakteristik i fotoregulované varianty, jejichž záři lze „zapínat a vypínat“ ozářením ultrafialovým zářením. záření. V současné době lze říci, že na základě ZFP vznikla a stále přibývá celá „armáda“ různých fluorescenčních proteinů (FP). Možnost využití PB byla prokázána ve studiích mnoha typů buněk od bakterií po savce.
„Osud“ equorinu zatím vypadá ve srovnání se ZFB poněkud „umírněně“. Byla také stanovena jeho struktura a byla syntetizována DNA kódující tento protein. Studium závislosti chemiluminiscence ekvorinu na vápenatých iontech umožnilo vyvinout metody měření koncentrace kationtu v některých buňkách. Pro měření obsahu vápenatých iontů uvnitř buněk existují i fluorescenční reportéry včetně derivátů PB. Výhodou chemiluminiscenční metody využívající ekvorin je však absence potřeby fluorescenčně excitujícího ozařování, které není pro biologický systém vždy neškodné, a to i pro fluorofory, jejichž luminiscence je delším ozařováním oslabena (fotobělicí efekt) . Aequorin patří do poměrně velké skupiny tzv. luciferinů – látek odpovědných za bio(chemi)luminiscenci u některých mořských a suchozemských organismů. Studium luciferinů je zajímavé nejen pro účely jejich praktické aplikace. Koneckonců stále není známo, proč biologické objekty obecně potřebují bioluminiscenci.
V posledních letech se zájem o tvorbu fluorescenčních reportérů na základě anorganické fluorofory tvorbou tzv biokonjugáty, těch. jejich komplexy s určitými organickými sloučeninami a/nebo biologickými molekulami. Mnoho atomů, například přechodné kovy, lanthanoidy (přesněji jejich ionty, například Tb 3+ a Eu 3), shluky několika atomů zlata a stříbra po vytvoření takových komplexů získávají schopnost senzibilizované fluorescence. Podstatou jevu je, že energie světla absorbovaného organickou sloučeninou je přenesena na atom anorganického prvku, který emituje fluorescenci. Důležitou vlastností tohoto procesu je, že molekuly donoru energie přenášejí energii z elektronů v tripletovém stavu. Proto záření anorganické fluorofory v takovém komplexu jsou „pomalé“ ve srovnání s „obyčejnou“ fluorescencí, protože životnost elektronů v tripletovém stavu je znatelně delší než ve stavu singletovém (viz tabulka 1). Kromě toho mají fluorescenční spektra anorganických biokonjugátů malou šířku a jsou silně posunuta vzhledem k absorpčním spektrům. Senzibilizovaná fluorescence biokonjugátových reportérů je činí „užitečnými“ z hlediska technik detekce záření. Používají se tedy zejména v podmínkách, kdy studovaný systém má „běžnou“ fluorescenci ostatních složek ve stejném rozsahu vlnových délek.
Zvláštní místo v této skupině zaujímají reportéry biokonjugátů, ve kterých jsou jako fluorofor použity polovodičové krystaly o velikosti 2–10 nm (nanokrystaly), tzv. kvantové tečky* (anglicky) kvantové tečky). Kvantové tečky se typicky skládají z páru prvků skupiny III/V (např. CdS, CdSe, ZnS) nebo prvků skupiny II/VI (např. GaN, InP, InAs). Vzhledem k malé velikosti polovodičových krystalů (obsahují pouze 10–50 atomů!) jsou pro jejich elektrony vytvořeny podmínky pro kvantované energetické přechody, podobné těm, které existují v jednotlivých atomech. (Kvantové tečky se někdy dokonce nazývají „umělé atomy“). Navíc energie těchto přechodů a tím i vlnová délka fluorescence závisí na velikosti krystalu. Čím menší krystal, tím větší energie záření, tzn. kratší vlnová délka fluorescence (obr. 5). Tato vlastnost otevírá možnost vytvářet kvantové tečky s téměř jakoukoli spektrální konfigurací. Nutno dodat, že oproti organickým fluoroforům mají také vyšší kvantový výtěžek a fotostabilitu. Na Obr. Obrázek 6 ukazuje přibližné velikosti různých reportérových fluoroforů.
* - Pro ty, které toto jméno zaujalo, si přečtěte podrobný článek « » . - Ed.
Obrázek 5. Fluorescence koloidních roztoků kvantových teček různých velikostí.
Biokonjugáty založené na kvantových tečkách se skládají z jádra (například CdSe), potaženého vrstvou polovodičového materiálu (například ZnS), který plní „ochrannou“ funkci, a ligandu - nějaké organické látky, která zajišťuje rozpustnost a /nebo připojení biologických molekul.
Obrázek 6. Relativní velikosti fluorescenčních reportérů. Pro srovnání je také uveden proteinový imunoglobulin G (Ig G).
Bioorganický obal biokonjugátu zajišťuje jeho stabilitu jako koloidní částice a tvoří „úkol“ reportéra, jeho zamýšlený účel: kde as čím interagovat, jaké „sbírat a přenášet“ informace. V tomto případě se samozřejmě může velikost reportéru na základě kvantové tečky výrazně zvětšit (obr. 6 ukazuje přibližné velikosti kvantových teček bez „vybavení“ biokonjugátem). Bioorganický obal může obsahovat sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností - jako je biotin - a sloučeniny s vysokou molekulovou hmotností: fragmenty jednovláknové DNA (oligonukleotidy) a proteiny, včetně enzymů a protilátek (Ig G).
Historicky je naše oko první na seznamu nástrojů pro příjem a analýzu „zpráv“ fluorescenčních reportérů. S jeho pomocí je možné provádět vizuální pozorování fluorescenční záře na makroskopických objektech přímo a na mikroskopických objektech pomocí fluorescenčního (luminiscenčního) mikroskopu. Příkladem makroskopických objektů jsou kolonie mikroorganismů, ve kterých jsou exprimovány PB, chromatogramy a elektroferogramy využívající fluorescenční barviva. A „běžný“ fluorescenční mikroskop (více o „neobvyklých“ mikroskopech o něco později) se nejčastěji používá k detekci imunologických reakcí pomocí fluoroforem značených protilátek, stejně jako v některých studiích na úrovni jedné buňky. Možnosti vizuální analýzy jsou však výrazně omezené, a to především kvalitní hodnocení „signálů“ fluorescenčních reportérů: „v určité oblasti vzorku je záře - není žádná záře“. Mnohem více informací lze získat, pokud „čtete a dešifrujete“ fluorescenční „zprávy“. kvantitativní charakteristika žhavení (viz část "Jazyk" fluorescenčních reportérů).
Pro kvantitativní charakterizaci fluorescence jsou nutná měření pomocí speciálních přístrojů a specifická metodika. Obvykle lze rozlišit dvě metodologie měření parametrů fluorescence. První slouží k měření různých fluorescenčních charakteristik v relativně velké (makroskopické) oblasti objektu, která poskytuje integrální ( zprůměrováno) fluorescenční charakteristiky předmětu: roztok, suspenze koloidních částic, buňky, subcelulární částice atd. Druhá metodika se zaměřuje na měření na úrovni jednotlivé mikroskopické objekty- především buňky a subcelulární částice.
Integrální měření fluorescence se provádějí pomocí spektrofluorimetrů (fluorescenční spektrofotometry) a deskových fluorimetrů ( angličtina. čtečky desek). Spektrofluorometry jsou zpravidla analytické přístroje, které lze použít k získání všech hlavních charakteristik fluorescence. Deskové fluorimetry jsou zařízení určená pro hromadnou analýzu velkého počtu vzorků (standardní destičky jsou určeny pro 96, 384 nebo 1536 vzorků). Měření v nich probíhá podle několika pevných charakteristik - například intenzity fluorescence v určité spektrální oblasti. Nedávno se objevily tabletové fluorimetry se schopností měřit parametry rozpadu fluorescence a tím odhadnout životnost fluoroforů v excitovaném stavu. Většina technik využívajících deskové fluorimetry je založena na imunologických reakcích nebo na analýze vývoje buněčných kultur v monovrstvách.
Metodika měření fluorescence jednotlivých mikroskopických objektů má také dvě možnosti. První je založen na získávání digitálních snímků fluorescenčních mikroobjektů ( angličtina. fluorescenční zobrazování) následované počítačovou analýzou ( angličtina. počítačová analýza obrazu). Druhým je měření fluorescence mikroobjektů v proudu při průchodu úzkou kapilárou speciálního zařízení - průtokového cytometru ( angličtina. průtokový cytometr).
Digitální snímky fluorescenčních mikroobjektů jsou získávány pomocí fluorescenční mikroskopie, která v poslední době zažila skutečnou technickou revoluci. Zejména spolu se standardními fluorescenčními mikroskopy, výrazně vylepšenými digitálními fotoaparáty a počítači byly vyvinuty zásadně nové přístroje. Jedná se především o tzv. konfokální mikroskopy (obr. 8). V konfokálním mikroskopu je fluorescence excitována a zaznamenána skrz mikroskopický otvor, který odřízne „přebytečné“ světlo, které se vyskytuje mimo ohnisko čočky. Skenováním této „optické zornice“ v horizontální a/nebo vertikální rovině, záznamem signálů fotonásobičem a zpracováním počítačem se získá prostorový obraz fluorescenčního objektu. Tato konstrukce primárně umožňuje čistší 2D a 3D obrazy ve srovnání se standardními mikroskopy. Kromě toho mohou moderní konfokální mikroskopy měřit parametry rozpadu fluorescence.
Obrázek 7. Konfokální mikroskop.
Jiný typ „revolučního“ mikroskopu funguje... v rozporu se základními fyzikálními principy fluorescence. Atomy v nich jsou excitovány světlem o vlnové délce více vlnová délka fluorescence... (viz část Fluorescence: světlem indukovaná luminiscence). Ve skutečnosti nejsou při provozu těchto mikroskopů porušeny základní fyzikální zákony. Jednoduše při dostatečné intenzitě světelného toku s vlnovou délkou větší, než je vlnová délka možné fluorescence, mohou dva fotony současně „zasáhnout“ stejný atom, energie absorbovaná elektrony se zdvojnásobí a ukáže se jako dostatečná k vybuzení fluorescence. Proto se takovým mikroskopům říká dvoufotonový. Současný „zásah“ dvou fotonů do jednoho atomu je poměrně nepravděpodobný jev a může nastat pouze tam, kde je světelný tok maximálně koncentrovaný, tzn. v ohnisku objektivu. To zajišťuje fluorescenční obrazy s vysokým rozlišením. Mezi výhody, kterými se dvoufotonové mikroskopy odlišují od ostatních mikroskopů, patří také jejich schopnost zaznamenat fluorescenci ve vzorcích v hloubce až 1,5 mm (objevují se zprávy o průniku do větších hloubek), stejně jako schopnost výrazně snížit nepříznivý efekt. vzrušujícího záření jak na studované objekty, tak na fluorescenční reportéry.
Speciální analytické techniky (tzv. fluorescenční korelační spektroskopie) umožňují využít konfokální a dvoufotonovou mikroskopii ke studiu pohybu jednotlivých (!) fluorescenčních molekul.
„Na vrcholu“ moderní optické mikroskopie z hlediska rozlišení jsou však takzvané „nanoskopy“, tedy mikroskopy, které umožňují rozlišit fluorescenční objekty v obraze, jejichž vzdálenost je několik nanometrů. Existují dva typy takových zařízení. První je založen na skenování vzorku dvěma úzkými paprsky laserového záření. Jejich optické vlastnosti jsou voleny tak, že jedna excituje fluorescenci v „potřebné“ oblasti a druhá ji potlačí v přilehlé „nepotřebné“ oblasti. Velikost „potřebné“ oblasti může být v řádu několika nanometrů. Tato metoda se nazývá STED mikroskopie.
Princip činnosti druhého typu nanoskopů je založen na schopnosti opticky „zapínat a vypínat“ fluorescenci jednotlivých fluoroforů. Obraz stejného vzorku se získá několikrát, včetně jedné nebo druhé z molekul. Počítač pak snímky „překryje“ přes sebe a na výsledném snímku je vidět záře každé z blízkých molekul. V „běžném“ mikroskopu, dokonce i konfokálním, by se spojily do jednoho světelného bodu. Tento přístup se nazýval PALM mikroskopie.
Fluorescenční „zprávy“ zaznamenané jako digitální obrázky jsou „dekódovány“, to znamená, že kvantitativní informace jsou extrahovány pomocí speciálních programů počítačové analýzy obrazu. Tímto způsobem je možné měřit intenzitu fluorescence a její prostorovou distribuci, vyhodnocovat spektrální charakteristiky záření (pseudospektrální analýza), určit počet fluorescenčních částic (např. buněk) a charakterizovat časové a polarizační parametry fluorescence.
Je třeba si také povšimnout estetického informačního obsahu fluorescenční mikroskopie. Fluorescenční reportéry na mikrosnímcích nám odhalují fascinující svět bizarních kombinací barev a tvarů (viz obr. 8). Výrobci mikroskopů Nikon a Olympus dokonce každoročně pořádají fotografické soutěže o mikrosvětě ve fluorescenčním světle. Galerie vítězných prací z těchto soutěží lze nalézt na webových stránkách Olympus BioScapes a Nikon Small World.
Obrázek 8. Fluorescenční mikrofotografie z galerie každoroční soutěže Nikon Small World. 1. Myší fibroblasty. 2. Copepod Temora longicornis. 3. Mitóza v plicních buňkách čolka. 4. Gliové buňky mozečku myši in vivo(dvoufotonová fluorescenční mikroskopie).
Na rozdíl od fluorescenčních mikroskopů vám průtokové cytometry neumožňují obdivovat fluorescenční objekty. Zpravidla se jedná o buněčné suspenze obsahující fluorofory. Síla průtokových cytometrů je rychlost záznamu signálů z jednotlivých objektů. Typický komerčně dostupný cytometr dokáže měřit fluorescenční signály z buněk rychlostí 1000 buněk za sekundu a specializované vysoce výkonné cytometry mohou měřit až 25 000 buněk za sekundu! Standardní verze práce zahrnuje měření dvou až deseti parametrů pro každý objekt: rozptyl světla a fluorescenci jednoho nebo více fluoroforů. Měření na velkém množství objektů umožňuje získat statisticky spolehlivé výsledky při studiu heterogenity buněčných, zejména mikrobiálních populací.
Spolu s konvenčními průtokovými cytometry existují přístroje, které jsou schopny fyzicky separovat (třídit) buňky podle určitých parametrů rozptylu světla nebo fluorescence. To otevírá možnost dalšího studia určitých subpopulací pomocí jiných metod.
Jak již bylo uvedeno (viz část Fluorescenční reportéři), všechny fluorescenční reportéry mají „specializaci“, tzn. schopné selektivně charakterizovat určité vlastnosti biologického systému. Podívejme se krátce na některé kategorie „specialistů“.
K monitorování lze použít řadu fluorescenčních reportérů enzymatická katalýza. Zpravidla se jedná o organické fluorofory. Například substráty jsou vytvořeny s kovalentně připojenými fluorofory, které začnou fluoreskovat až po uvolnění během reakce. To slouží jako „zpráva“ o postupu enzymatické katalýzy. Další technikou je použití "profluoroforu", který se stává fluorescenčním v důsledku interakce s reakčním produktem. Pomocí fluorescenčních reportérů enzymatických reakcí je studována dynamika procesů a také jejich lokalizace v buňkách, tkáních, orgánech atd.
Reportéři tvoření na základě protilátek „informují“ o průběhu imunologické reakce. Jsou to fyzikální komplexy nebo kovalentní sloučeniny fluoroforů s protilátkami (imunoglobuliny). Jako fluorescenční složka se ukázala možnost použití všech známých organických i anorganických fluoroforů, včetně kvantových teček. Kromě toho mohou být enzymy připojeny k protilátkám, aby katalyzovaly reakce za vzniku fluorescenčního produktu. Pomocí imunologických fluorescenčních reportérů je detekována přítomnost určitých antigenních proteinů ve vzorcích a také jejich lokalizace. Například mikrofibrily v myších fibroblastech znázorněné na obrázku 8 (foto 1) byly detekovány pomocí fluorescenčních protilátek.
Pomocí FB lze získat mnoho typů informací. Byly vyvinuty metody pro vytvoření hybridních proteinových genů obsahujících PB jako fluorescenční značku některého přírodního proteinu nebo dokonce nukleové kyseliny. Zavedení genů takových „hybridů“ do buněk umožňuje určit „adresy“ fluorescencí lokalizace molekulárních složek živých buněk, sledovat dynamiku jejich syntézy a pohybů. Fluorescence hybridních proteinů obsahujících PB je závislá na pH, k čemuž se používá intracelulární měření pH. Výhodou těchto pH reportérů ve srovnání s jinými pH-senzitivními organickými fluorofory je schopnost měřit pH uvnitř různých intracelulárních kompartmentů (organel), kde je hlavní složka „hybridu“ „adresována“.
Zvláště zajímavé je použití různých FB v kombinaci s technikami měření fluorescence založenými na WPT. Studovat interakce nebo společná lokalizace v buňkách jakýchkoli dvou proteinů jsou k nim připojeny dva FB, vybrané tak, že když se spojí, je možný efekt WPT. Podobným způsobem lze studovat konformační (strukturální) změny v proteinech. Za tímto účelem jsou odpovídající PB připojeny k různým částem molekuly proteinu. Výskyt WPE efektu ukazuje na konvergenci FB a tím i na konformační přeuspořádání ve studovaném proteinu. „Konstrukt“ tří proteinů funguje na stejném principu, který se používá jako indikátor obsah Ca 2+ iontů v živých buňkách. Zahrnuje dva PB a mezi nimi Ca2+-vazebný protein kalmodulin. Při vazbě Ca 2+ se mění konformace kalmodulinu, FB se k sobě přibližují a dávají signál WPE. Zde je vhodné poznamenat, že pro záznam Ca2+ iontů uvnitř buněk existují také „jednoduché“ organické fluorescenční reportéry. Proteinové reportéry lze přesněji „zacílit“ na specifické intracelulární složky buď pomocí mikroinjekcí, nebo začleněním do struktury proteinu se specifickou intracelulární lokalizací.
Citlivost fluorescence na fyzikální vlastnosti mikroprostředí, ve kterém se molekuly fluoroforů nacházejí, umožňuje využití některých z nich jako reportérů různých parametrů intracelulárního prostředí. Měření intracelulární viskozita na základě závislosti fluorescenční polarizace na rotační difuzi reportérů. Díky speciálně vybraným reportérům se podařilo změřit viskozitu cytoplazmy uvnitř některých organel i v hydrofobní vrstvě biomembrán. Interakce některých fluoroforů s biologickými membránami závisí na rozdílu elektrického potenciálu mezi nimi. S pomocí takových reportérů se získávají informace o hodnotě membránový potenciál. K měření intracelulární teplota Bylo vyvinuto několik verzí fluorescenčních reportérů založených na lanthanoidech, kvantových tečkách, termosenzitivních polymerech a organických fluoroforech. Nejpůsobivější výsledky byly získány ze speciálně navržených organických fluoroforů, které jsou schopny „hlásit“ teplotu v různých částech buněk, „zakódovanou“ v dynamických parametrech rozpadu fluorescence.
Fluorescenční reportéři dlouho a úspěšně „sloužili“ experimentální biologii a medicíně. Jen výčet různých možností jejich použití by mohl zaplnit nejeden článek. Existují však oblasti, kde sehrály klíčovou roli při studiu základních vlastností a jevů biologických systémů. Uveďme si pro ilustraci některé z nich.
Bylo to experimentálně prokázáno pomocí fluorescenčních reportérů model struktury tekutých krystalů všech biologických membrán*. Podle tohoto modelu, se strukturální integritou a zajištěním propustné bariéry pro hydrofilní látky, je biologická membrána dostatečně „kapalná“, aby se v ní její jednotlivé složky mohly pohybovat „jak bylo zamýšleno“. Toto pochopení biologických membrán nám umožňuje pochopit základní molekulární mechanismy jejich fungování a také vlastnosti živých buněk obecně.
* - I díky fluorescenčním technikám bylo zjištěno, že membrána není jen pasivní „moře“ fosfolipidů, ve kterém plavou „ostrovy“ membránových proteinů, ale plnohodnotný účastník mnoha důležitých biofyzikálních procesů: « » . - Ed.
Mechanismy přeměny energie v buňkách se také staly pochopeny z velké části díky informacím od fluorescenčních reportérů. Zvláštní roli zde sehrály fluorofory, které umožnily zaznamenat intracelulární a intramitochondriální pH* a také rozdíl elektrického potenciálu na membránách. S jejich pomocí byl především identifikován mechanismus spojování oxidačních reakcí poskytujících energii s energeticky náročnou syntézou adenosintrifosfátu (ATP), univerzálního dárce energie pro většinu metabolických procesů. Kromě toho byl studován charakter akumulace různých látek v cytoplazmě a v buněčných organelách v důsledku membránového elektrického potenciálu a gradientu pH.
* - o konstrukci fluorescenčního pH senzoru viz článek « » . - Ed.
Životně důležitá činnost buněk je zajištěna kombinací o koordinované v prostoru a čase biochemické reakce. Tato koordinace se uskutečňuje díky specifické interakci složek tzv signál systémy Hlavní složky těchto systémů byly izolovány a charakterizovány pomocí tradičních biochemických a molekulárně biologických technik. Avšak teprve s příchodem přístupů založených na použití fluorescenčních reportérů bylo možné získat informace o časoprostorová organizace signálních drah přímo v buňkách. Zejména je tak možné v reálném čase sledovat prostorovou dynamiku interakce proteinových složek signálních systémů. To umožňuje studovat šíření, amplifikaci a integraci signálů v buňkách. Navíc je možné hodnotit dynamiku genové exprese na úrovni jedné buňky, což nám umožňuje přistupovat k vývoji konceptů buněčné individuality na rozdíl od tradičních statistických přístupů. Je třeba také poznamenat, že pomocí fluorescenčních reportérů bylo možné detekovat dříve neznámé signální složky. Například byla odhalena zásadní role Ca 2+ iontů jako signalizačního prostředníka v mnoha regulačních reakcích.
Ve druhé polovině minulého století se v mikrobiologii objevil problém, který byl nazván „velká anomálie počítání mikroorganismů pomocí Petriho misek“. Ukázalo se, že „viníky“ jsou fluorescenční reportéři, dvě barviva nukleových kyselin – akridinová oranž a 4,6-diamidino-2-fenylindol. V četných studiích přírodních vzorků byl konzistentně zjištěn rozpor mezi údaji o obsahu mikroorganismů získanými počítáním kolonií proliferujících buněk v Petriho miskách a údaji z přímých počtů mikroorganismů obarvených fluorescenčními barvivy nukleových kyselin pomocí mikroskopie. Fluorescenční reportéry vždy detekovaly výrazně více mikroorganismů než Petriho miska. Pro vysvětlení těchto údajů byly předloženy dvě hypotézy. Podle prvního mohou být některé buňky v určitém „klidovém stavu“ a nemnoží se v Petriho miskách. Podle druhého podmínky pěstování (složení média, teplota atd.) neodpovídají „potřebám“ některé části populace na reprodukci. Testování těchto hypotéz ukázalo, že obě tyto možnosti lze realizovat. Navíc byl dán impuls k vytvoření dvou nových hlavních oblastí výzkumu.
První souvisí se studiem takzvaného „životaschopného, ale nekultivovatelného stavu mikroorganismů“. Zvláštní význam této oblasti je způsoben přítomností takového stavu u mnoha mikroorganismů patogenních pro člověka. V tomto stavu jsou pro standardní diagnostické metody jakoby „neviditelné“. Navíc se v tomto stavu stávají odolnějšími vůči lékům.
Druhým směrem je identifikace a studium mikroorganismů přímo v přírodních vzorcích (lat. in situ, doslova - na místě) přímou analýzou jejich nukleových kyselin bez předchozího získání čistých kultur, jak tomu bylo dříve. Tento směr dokonce dostal své jméno - metagenomika. Díky metagenomickým metodám, z nichž některé jsou mimochodem založeny na využití fluorescenčních reportérů, se podařilo přehodnotit biologickou diverzitu mikroorganismů v jednotlivých ekosystémech i na Zemi jako celku. Tak přispěly „jednoduché“ zprávy dvou fluorescenčních reportérů ke vzniku dvou nejdůležitějších oblastí výzkumu v moderní mikrobiologii.
Fluorescenční reportéři tedy dnes představují velkou armádu různorodých „specialistů“, kteří již mají hrdou historii v experimentální biologii a medicíně. Jejich fluorescenční zprávy umožnily lépe „vidět“ ta zákoutí mikrosvěta, kam může světlo pronikat. Navíc je to vidět nejen vizuálně, ale také z hlediska pochopení fyzikálně-chemických a biologických zákonitostí. A přesto výzkumníci pracující na vývoji a aplikaci těchto „molekulárních asistentů“ pro studium mikrosvěta věří, že je to jen začátek!
Klasifikace elektronických přechodů
Jablonského diagram
Fyzikální procesy probíhající v elektronicky excitovaném stavu molekul jsou obvykle znázorněny ve formě Yablonskyho diagramu. Hlavní neradiační procesy deaktivace spodního excitovaného stavu S 1 jsou vnitřní konverze (přechod mezi stavy stejné násobnosti) a interkombinační konverze (přechod mezi stavy různé násobnosti, např. přechod singlet-triplet S1®T1). Vnitřní konverze S 1® S 0– relativně pomalý proces. Proto ve vzrušeném stavu S 1 lze pozorovat procesy spontánní emise fotonů (spontánní emise) a fotochemické reakce. Radiační procesy jsou spinově povolená fluorescence a spinově zakázaná fosforescence.
Elektronická absorpční spektra v UV a viditelné oblasti poskytují důležité informace o struktuře a vlastnostech elektronicky excitovaných stavů molekul. Znalost absorpčního spektra látky je předpokladem pro fotoluminiscenční a fotochemické studium. Podívejme se krátce na klasifikaci elektronických přechodů
Elektrony v organické molekule jsou umístěny na molekulových s-, p- a n-orbitály. Každý molekulární orbital obsahuje dva elektrony s různými spiny. Když je molekula excitována světlem, elektron přechází z obsazeného vazebného orbitalu na volný antivazebný orbital. Takové přechody jsou označeny v souladu s jejich orbitální povahou: s-s*, n-s*, p-p* a n-p*.
Absorpční pásy kvůli přechody s®s*, se nacházejí převážně ve vakuové UV oblasti< 200 нм, где обычные спектрофотометры не применимы.
Přechody n-s* odpovídají absorpčním pásům v UV oblasti. Například organické sloučeniny obsahující n-elektrony lokalizované v orbitalech heteroatomů, O, N, S, absorbují UV světlo v oblasti asi 200 nm.
Přechody p®p* A n®p* odpovídají absorpčním pásům ve střední UV oblasti. Když jsou konjugovány vícenásobné vazby, pásy způsobené těmito přechody jsou posunuty do blízkých UV a viditelných oblastí spektra. Přechody n®p* jsou charakteristické pro sloučeniny obsahující takové chromoforické skupiny jako C=O, C=S, N=N; tyto přechody se často ukazují jako zakázané a odpovídající absorpční pásy mají relativně nízkou intenzitu.
Tato klasifikace je vhodná především pro relativně jednoduché molekuly. Ve složitých molekulách mohou elektrony umístěné v orbitalech různých typů určitým způsobem přispět k elektronovému přechodu.
Značný zájem jsou elektronické přechody s přenosem náboje. Pokud molekula obsahuje elektron-donorové a akceptorové skupiny a jsou v p-elektronové konjugaci, pak může být přechod S 0 ® S 1 doprovázen přenosem náboje z donoru na akceptor podél konjugačního řetězce, jako např. , v tomto styrylovém barvivu:
V tomto případě hovoříme o elektronickém přechodu s vnitřní převod náboje. Odpovídající absorpční pásy se obvykle vyznačují vysokou intenzitou a nacházejí se ve viditelné a někdy v blízké IR oblasti.
U slabě vázaných organických komplexů donor-akceptor lze pozorovat absorpční pásy související s elektronickým přechodem s přenosem náboje z donoru na akceptor prostorem ( přenos mezimolekulárního náboje). Takové komplexy se často nazývají komplexy přenosu náboje. Dlouhovlnné absorpční pásy takových komplexů mají relativně nízkou intenzitu a mohou být umístěny v blízké UV, viditelné a blízké infračervené oblasti spektra.
V organokovové chemii se rozlišují absorpční pásy odpovídající přenosu náboje z ligandu na kov ( PZLM) a od kovu k ligandu ( PZML).
Luminiscence nastává po absorpci světla a je to radiační přechod z elektronicky excitovaných stavů do základního stavu. V závislosti na povaze základního a excitovaného stavu lze luminiscenci rozdělit na dva typy. Jak je známo, spiny elektronů, z nichž jeden je v základním singletovém stavu a druhý v excitovaném singletovém stavu, mají opačnou orientaci (spiny elektronů jsou párové). Přechod elektronu z excitovaného singletového stavu do základního singletového stavu je kvantově mechanicky povolen, protože v tomto případě by ke změně spinové orientace nemělo dojít. Jiná situace je pozorována pro tripletový stav, ve kterém má elektronový spin stejnou orientaci jako elektronový spin v základním singletovém stavu. Proto, když elektron přechází z tripletového stavu do základního singletového stavu, je nutná změna orientace elektronového spinu. A tento proces je kvantově mechanicky zakázán.
Je zřejmé, že pro tyto dva typy elektronových přechodů se musí emisní rychlosti výrazně lišit. Pro kvantově mechanicky rozlišené singlet-singletové přechody jsou typické emisní rychlosti ~ 108 s-1, což odpovídá dobám rozpadu luminiscence ~ 10-8 s. Tento typ luminiscence se nazývá fluorescence. Druhý typ luminiscence se nazývá fosforescence a je to emise, ke které dochází během přechodu mezi stavy různé multiplicity, obvykle z excitovaného tripletového stavu do singletového stavu. Vzhledem k tomu, že tyto přechody jsou kvantově mechanicky zakázány, typický rozsah časů rozpadu fosforescence se pohybuje od mikrosekund do sekund, což závisí především na přispění dalších procesů deaktivace energie elektronů v excitovaném stavu. V závislosti na délce dosvitu lze tedy luminiscenci rozdělit na fluorescenci a fosforescenci.
Procesy absorpce a emise světla bez ohledu na změny jaderných souřadnic lze názorně demonstrovat pomocí Jablonského diagramu (viz obr. 1).
Rýže. 1. Jablonského diagram znázorňující energetické hladiny
molekul a rychlosti přechodu. Přímky - radiační přechody,
vlnité - nezářivé přechody
Stav základního singletu a první a druhý excitovaný singletový stav označujeme jako SO, S1, S2. Každá z těchto energetických úrovní se může skládat z mnoha vibračních podúrovní, které se zase skládají z mnoha rotačních podúrovní (nezobrazeno na obr. 1).
Podle Boltzmannovy distribuce je při pokojové teplotě většina molekul na nejnižší vibrační úrovni základního singletového stavu S0. Právě takové molekuly budou převážně absorbovány.
náhradní záření.
K excitaci tedy obvykle dochází od základního singletového stavu S0 do různých vibračních úrovní excitovaných singletových stavů Sn (n = 1, 2, ...). Přechody mezi různými podúrovněmi jsou znázorněny rovnými čarami. Tato reprezentace se používá k zobrazení okamžité povahy absorpce světla. K tomuto procesu dochází v čase řádově periodě světelných oscilací, tzn. za cca 10-15s. Během této doby jádra neprojdou znatelným posunem (Frank-Condonův princip).
Dále je pro molekuly v kondenzované fázi nejpravděpodobnějším procesem jejich přechod z excitovaných singletových stavů do nejnižší vibrační úrovně excitovaného stavu S1 v důsledku rychlých nezářivých přechodů (vnitřní konverze) v čase řádově femtosekund. Protože typické doby rozpadu fluorescence jsou blízké 10-8 s, vnitřní konverze obvykle končí před událostí emise. Proto se fluorescenční emise nejčastěji provádí z tepelně rovnovážného excitovaného stavu.
Reverzní radiační přechod elektronů (fluorescence), podobný aktu absorpce, může nastat do různých vibračních úrovní základního singletového stavu S0 s rychlostí Kf. Poté procházejí neradiační deaktivací na hlavní vibrační úroveň v čase cca 10-12s.
Molekuly ve stavu S1 mohou také podléhat jiným přechodům. Například je možný nezářivý přechod (vnitřní konverze) do stavu S0 rychlostí Kvk a nezářivý přenos energie do sousedních molekul rychlostí Kpe. Kromě toho mohou molekuly ve stavu S1 také podstoupit mezisystémovou křížovou konverzi do prvního tripletového stavu T1 rychlostí Kkk. Dále je možný radiační přechod molekuly z tripletového stavu do základního singletového stavu (fosforescence). Jak však bylo řečeno dříve, takový přechod je kvantově mechanicky zakázán, v důsledku čehož je rychlostní konstanta pro fosforescenci o několik řádů menší než odpovídající konstanta pro fluorescenci.
Součet všech kinetických rychlostí je nepřímo úměrný době života τ excitovaného stavu S1, tj.:
Poměr představuje kvantový výtěžek fluorescence. Emise fluorescence může být ovlivněna i jinými faktory, například zhášením luminiscence, vlivem rozpouštědla atd.
E. O. Puchkov,
Doktor biologických věd, Ústav biochemie a fyziologie mikroorganismů pojmenovaný po. G.K. Skrjabin RAS
„Chemie a život“ č. 9, 2014
Dva články v tomto čísle Chemie a život hovoří o záři biologických objektů. Na fotce vlevo je červ mnohoštětinový Fridericia heliota, objevili vědci z Krasnojarské univerzity. Přečtěte si o tom, jak byl jeho luciferin, látka, která po oxidaci enzymem luciferázou vyzařuje namodralé světlo, studován v článku „Světla pod nohama“. Na fotografii vpravo syntetický Fridericia luciferin v přítomnosti ATP a dalších nezbytných složek vykazuje stejnou záři jako proteinový extrakt červa. To potvrzuje, že struktura luciferinu byla stanovena správně.
Na rozdíl od fluorescenčních mikroskopů vám průtokové cytometry neumožňují obdivovat fluorescenční objekty. Jejich silnou stránkou je rychlost záznamu signálů z jednotlivých objektů, například z buněk v suspenzi. Typický komerčně dostupný cytometr pracuje rychlostí 1000 buněk za sekundu, zatímco specializované vysoce výkonné cytometry pracují rychlostí až 25 000 buněk za sekundu! Ve standardní verzi se pro každý objekt měří od dvou do deseti parametrů: rozptyl světla a fluorescence jednoho nebo více fluoroforů. Tímto způsobem je možné získat statisticky spolehlivé výsledky o heterogenitě buněčných, zejména mikrobiálních populací. Existují také přístroje, které dokážou třídit buňky na základě specifických parametrů rozptylu světla nebo fluorescence, takže subpopulace pak mohou být studovány pomocí jiných metod.
...A co se od nich dá naučit
Takže všichni fluorescenční reportéři mají specializaci, to znamená, že jsou schopni selektivně charakterizovat určité vlastnosti biologického systému. Podívejme se krátce na některé kategorie „specialistů“.
Pomocí řady fluorescenčních reportérů (nejčastěji organických fluoroforů) je možné sledovat enzymatickou katalýzu - studovat dynamiku enzymatických reakcí, jejich lokalizaci v buňkách, tkáních, orgánech apod. Jedná se např. o substráty s kovalentně navázanými fluorofory , které začnou fluoreskovat až po uvolnění během reakce, nebo "profluorofory", které fluoreskují při interakci s reakčním produktem.
O průběhu imunologických reakcí informují reportéry tvořené na bázi protilátek - fyzikálních komplexů nebo kovalentních sloučenin fluoroforů s protilátkami. Fluorescenční složkou může být jakýkoli ze známých organických a anorganických fluoroforů, včetně kvantových teček. Kromě toho mohou být enzymy připojeny k protilátkám, aby katalyzovaly reakce za vzniku fluorescenčního produktu. Moderní technologie umožňují získat protilátky proti libovolnému proteinu (antigenu), který je pro výzkumníka zajímavý, zatímco protilátka s fluorescenční značkou tento protein nebo strukturu z něj vybudovanou rozzáří. Například pomocí fluorescenčních protilátek byly identifikovány mikrofibrily v myších fibroblastech (viz foto na druhé titulní straně).
Metody využívající fluorescenční proteiny (FP) jsou velmi informativní. Již jsme zmínili, jak užitečné jsou metody pro zavádění hybridních proteinových genů do buňky, které způsobují fluorescenci přirozeného proteinu nebo dokonce nukleové kyseliny. Fluorescence hybridních proteinů obsahujících PB je navíc závislá na kyselosti média, což umožňuje měřit pH nejen uvnitř buňky, ale i uvnitř jednotlivých organel, pokud je takový protein „adresován“ jádru resp. mitochondrie.
Obzvláště zajímavé je použití PB v kombinaci s technikami měření fluorescence založenými na neradiačním přenosu energie. Představte si dva hybridní proteiny, z nichž jeden způsobí, že druhý fluoreskuje, když se spojí. Podobným způsobem můžete studovat konformační (strukturální) změny v proteinech, pokud PB připojíte k různým částem stejné molekuly proteinu.
Citlivost fluorescence na fyzikální vlastnosti mikroprostředí fluoroforů umožňuje využití některých z nich jako reportérů různých parametrů intracelulárního prostředí. Patří mezi ně např. viskozita cytoplazmy, vnitřní obsah organel a hydrofobní vrstva biomembrán. Interakce některých fluoroforů s biologickými membránami závisí na rozdílu elektrického potenciálu na membráně: pomocí takových reportérů se získá informace o velikosti membránového potenciálu. Existují dokonce reportéři, kteří měří intracelulární teplotu!
Nejen na oko
Možnosti vizuální analýzy jsou omezeny především kvalitativním hodnocením: „existuje záře – neexistuje záře“. Mnohem více informací poskytují kvantitativní charakteristiky (viz kapitola „Jazyk fluorescenčních reportérů“).
Ke kvantifikaci fluorescence se používají dvě metodiky. První slouží k měření různých fluorescenčních charakteristik v relativně velké (makroskopické) oblasti objektu, která poskytuje průměrné charakteristiky pro objekt: roztok, suspenze koloidních částic, buňky, subcelulární částice atd. Druhá je zaměřena na jednotlivé mikroskopické objekty, především buňky a subcelulární částice.
Integrální měření fluorescence se provádějí pomocí spektrofluorimetrů (fluorescenční spektrofotometry) a deskových fluorimetrů (angl. čtečky desek). Spektrofluorimetry jsou zpravidla analytické přístroje, na kterých lze získat všechny hlavní charakteristiky fluorescence. Tabletové fluorimetry jsou zařízení pro analýzu velkého počtu vzorků (někdy i více než tisíců), ale pouze podle několika pevných charakteristik, například intenzity fluorescence v určité spektrální oblasti a/nebo životnosti fluoroforů v excitovaném stavu. Většina technik využívajících deskové fluorimetry je založena na imunologických reakcích nebo na analýze vývoje buněčných kultur v monovrstvách.
Metodika měření fluorescence jednotlivých mikroskopických objektů má také dvě možnosti.
První je založen na získávání digitálních snímků objektů s následnou počítačovou analýzou. Druhým je měření fluorescence mikroobjektů v toku „kus po kousku“ při průchodu úzkou kapilárou speciálního zařízení – průtokového cytometru.
Fluorescenční mikroskopie nedávno prošla skutečnou revolucí: byla vyvinuta nová zařízení, především konfokální mikroskopy, ve kterých je fluorescence excitována a zaznamenávána skrz mikroskopický otvor, který odřízne „extra“ záři, která se vyskytuje mimo ohnisko čočky. Tento „žák“ snímá obraz v horizontální a/nebo vertikální rovině, signály zaznamenává fotonásobič a po počítačovém zpracování se získá prostorový obraz předmětu. Tento design umožňuje ostřejší 2D a 3D obrazy než standardní mikroskopy. Kromě toho mohou moderní konfokální mikroskopy měřit parametry rozpadu fluorescence.
Jiný typ „revolučního“ mikroskopu funguje zdánlivě v rozporu se základními fyzikálními principy fluorescence. Atomy v nich jsou excitovány světlem s vlnovou délkou delší než má fluorescence, nikoli kratší. Ve skutečnosti se při provozu těchto mikroskopů neporušují žádné fyzikální zákony jednoduše, při dostatečné intenzitě světelného toku s delší vlnovou délkou mohou dva fotony současně vstoupit do stejného atomu, energie absorbovaná elektrony se zdvojnásobí a je to; dostatečné k vybuzení fluorescence. Proto se takové mikroskopy nazývají dvoufotonové mikroskopy. A protože je světelný tok maximálně koncentrovaný v ohnisku objektivu, jsou zajištěny snímky s vysokým rozlišením. Dvoufotonové mikroskopy se také vyznačují schopností zaznamenat fluorescenci ve vzorcích v hloubce až 1,5 mm a schopností výrazně snížit nepříznivý vliv excitačního záření jak na studované objekty, tak na fluorescenční reportéry.
Kvantitativní informace se získávají z digitálních snímků pomocí programů počítačové analýzy obrazu. Měří se intenzita fluorescence a její prostorové rozložení, hodnotí se spektrální charakteristiky záření, určuje se počet fluorescenčních částic, např. buněk, a charakterizují se časové a polarizační parametry fluorescence. Speciální analytické techniky (tzv. fluorescenční korelační spektroskopie) umožňují použití konfokální a dvoufotonové mikroskopie ke studiu pohybu i jednotlivých fluorescenčních molekul!
Co odhalili fluorescenční reportéři v mikrokosmu?
Fluorescenční reportéři dlouho a úspěšně slouží v mnoha, ne-li ve všech oblastech experimentální biologie. Jsou však oblasti, kde sehrály klíčovou roli.
Pomocí fluorescenčních reportérů byl experimentálně prokázán model kapalné krystalické struktury všech biologických membrán. Podle tohoto modelu je membrána přes veškerou svou strukturální integritu dostatečně „tekutá“, aby se její jednotlivé součásti mohly pohybovat správnými směry. Toto znázornění nám umožňuje porozumět základním molekulárním mechanismům fungování membrán a také vlastnostem živých buněk obecně.
Z velké části díky informacím od fluorescenčních reportérů se mechanismy transformace energie v buňkách vyjasnily. Zvláštní roli zde sehrály fluorofory, které umožnily zaznamenat intracelulární a intramitochondriální pH a také rozdíl v elektrických potenciálech na membránách. S jejich pomocí byl především identifikován mechanismus spojení oxidačních reakcí poskytujících energii s energeticky náročnou syntézou adenosintrifosfátu (ATP) – univerzálního dodavatele energie pro většinu metabolických procesů. Kromě toho byl studován charakter akumulace různých látek v cytoplazmě a v buněčných organelách v důsledku membránového elektrického potenciálu a gradientu pH.
Životní činnost buněk zajišťuje soubor biochemických reakcí koordinovaných v prostoru a čase a za koordinaci odpovídají tzv. signální systémy. Hlavní složky těchto systémů byly izolovány a charakterizovány pomocí tradičních biochemických a molekulárně biologických technik. Avšak pouze přístupy založené na použití fluorescenčních reportérů přímo ukázaly, kde tyto dráhy leží a jak jimi signály procházejí, což umožnilo sledovat interakce signálních proteinů v reálném čase nebo posuzovat dynamiku genové exprese v jedné buňce. Pomocí fluorescenčních reportérů bylo také možné detekovat dříve neznámé signální složky, například odhalit roli iontů Ca + 2 jako signálního prostředníka v mnoha regulačních reakcích.
Ve druhé polovině dvacátého století se v mikrobiologii objevil problém, který byl nazván „velká anomálie počítání mikrobů pomocí Petriho misek“. Ukázalo se, že „viníky“ jsou fluorescenční reportéři, dvě barviva nukleových kyselin – akridinová oranž a 4,6-diamidino-2-fenylindol. Obsah mikroorganismů v přirozeném vzorku lze posoudit buď spočítáním kolonií vyrostlých na Petriho misce (při dostatečném naředění „inokula“ je každá kolonie tvořena potomky pouze jedné buňky), nebo přímým spočítáním samotných mikroorganismů. , obarvené fluorescenčními barvivy nukleové kyseliny, pod mikroskopem. Fluorescenční reportéry tedy vždy detekovaly podstatně více mikroorganismů než analýza s Petriho miskami.
K vysvětlení tohoto rozporu byly předloženy dvě hypotézy. Podle prvního se některé buňky, které jsou ve stavu klidu, v Petriho miskách nereprodukují. Podle druhého podmínky pěstování (složení média, teplota atd.) nevyhovují potřebám některé části populace. Testování těchto hypotéz ukázalo, že obojí je možné. Navíc byl dán impuls k vytvoření dvou nových hlavních oblastí výzkumu. První je spojena se studiem tzv. životaschopného, ale nekultivovatelného stavu mikroorganismů. Praktický význam takového výzkumu je zřejmý: například lidské patogeny v tomto stavu mohou být standardními diagnostickými metodami neviditelné a odolnější vůči lékům. Druhým směrem je identifikace a studium mikroorganismů v přírodních vzorcích přímou analýzou jejich nukleových kyselin, bez předchozího získání čistých kultur, jak tomu bylo dříve. Tento směr dostal svůj vlastní název – metagenomika. Díky metagenomickým metodám (mimochodem některé z těchto metod využívají použití fluorescenčních reportérů) je možné novým způsobem vidět biologickou diverzitu mikroorganismů v jednotlivých ekosystémech i na Zemi jako celku.
Moderní fluorescenční reportéři jsou tedy obrovskou armádou specialistů a mnozí z nich již mají velkou slávu v experimentální biologii. Jejich zprávy nám umožnily lépe vidět ta zákoutí mikrosvěta, kam může světlo nahlédnout. Mnoho výzkumníků pracujících v této oblasti se však domnívá, že vše, co jsme dosud ve fluorescenci viděli, je jen začátek!
Absorpce světla je jev poklesu intenzity světla při průchodu látkou. Ke snížení intenzity světla dochází v důsledku toho, že se světelná energie přeměňuje na jiné druhy energie: energii aktivace, ionizace molekul, energii tepelného chaotického pohybu částic v látce atd. Při monochromatickém světle prochází barevnými roztoky nízké koncentrace (C? 20 %) a za předpokladu, že rozpouštědlo neabsorbuje danou vlnovou délku, exponenciálně klesá i intenzita světla. Zákon absorpce světla pro barevné roztoky se nazývá Bouguer-Lambert-Beerův zákon: I= Io* e^- hcd, kde C je koncentrace roztoku; h - indikátor absorpce pro roztok o jednotkové koncentraci, závisí na povaze rozpuštěné látky a vlnové délce dopadajícího světla.
Chromofor je molekula schopná absorbovat světlo určitého rozsahu vlnových délek.
Karbonylová skupina CO je tedy chromofor, který absorbuje v oblasti 280 nm, zatímco ketony jsou bezbarvé látky.
Primárními fázemi fotobiofyzikálního procesu jsou absorpce světla chromoforovou skupinou a vznik elektronicky excitovaných stavů (EES). Když je světlo absorbováno, molekuly, ionty, atomy, radikály a další typy částic zapojených do chemických přeměn se mohou transformovat do elektronicky excitovaných stavů. V nich dochází ke změně fyzikálních a chemických vlastností molekul oproti základnímu stavu. Mění se dipólový moment, geometrie, rozložení hustoty elektronů, acidobazické vlastnosti atd. a molekuly v excitovaném stavu mají jinou reaktivitu, což se projevuje ani ne tak změnou rychlosti reakce, ale jejich rozdílným, srovnaným k základnímu stavu, směr. Absorpci a emisi světla dobře ilustruje diagram energetické hladiny navržený Jablonským
V základním stavu všechny elektrony zabírají nejnižší elektronické úrovně a jsou umístěny v orbitalech po párech, přičemž jejich spiny mají opačný směr (antiparalelní). Tento stav molekuly se nazývá singletový neexcitovaný (základní) stav a je označen jako SO. Také označuje energetickou hladinu nevybuzené molekuly
Při pohlcení světla se jeden z elektronů přesune na výše položený orbital, ale jeho spin se nezmění. Tento stav molekuly a její energetická hladina se označují jako S1 nebo S2, podle toho, do jaké hladiny elektron přešel. Tento singletový excitovaný stav je označen S*. Zemní, první a druhý elektronický stav jsou označeny S0, S1 a S2. Každá z těchto energetických úrovní se může skládat z více vibračních energetických úrovní, označených 0, 1, 2 atd. V tomto schématu není zohledněn účinek rozpouštědla. Přechody mezi různými elektronickými úrovněmi jsou označeny svislými čarami. Tato reprezentace se používá k vizualizaci okamžité povahy absorpce světla. Tento proces nastává přibližně za 10-15 s – čas příliš krátký na to, aby došlo ke znatelnému přemístění jader.
